3-5-1- شمارش افتراقي سلول­هاي خوني
شمارش افتراقی سلول­های خونی با بهره گرفتن از دستگاه Cell Counter XL22 در آزمایشگاه تشخیص طبی دکتر رازقی در شهر جهرم انجام شد.
شمارش سلول­هاي ايمني:
تعيين تعداد گلبول­هاي سفيد خون محيطي و شمارش افتراقي آنها به طور معمول با بهره گرفتن از شمارشگرهاي الكترونيكي انجام مي‌گيرد. در اين روش حجم مشخصي از خون تام از مجراي باريكي كه در هر زمان تنها يك سلول از آن مي‌گذرد، عبور داده مي‌شود. با شمارش افتراقي گلبول­هاي سفيد، نسبت جمعيت­هاي گلبول­هاي سفيد (مثل نوتروفيل، لنفوسيت، مونوسيت) مشخص مي‌شود. اين كار با بهره گرفتن از يك شمارشگر الكترونيكي و يا از طريق بافت شناسي و با بهره گرفتن از گسترش خون تام بر روي لام ميكروسكپي انجام مي‌شود. در اين روش تعداد مشخصي از سلول­ها كه معمولاً بيش از صد تا دويست عدد مي‌باشند، شمارش شده و نسبت هر دسته از آنها و همچنين تعداد مطلق هر جمعيت سلولي محاسبه مي‌گردد (مکینون^[90]، 1992).
3-5-2- اندازه ­گیری سایتوکاین­ها به روش ELISA
سنجش ایمنی با واکنش­گر پیوندی با آنزیم (ELISA)^[91]
سنجش ایمنی با واکنشگر پیوندی با آنزیم (ELISA) یکی از ساده­ترین و قابل اعتماد­ترین روش­هایی است که ایمونولوژیست­های ورزشی در اختیار دارند. در واقع گسترش روز افزون ELISA های تجاری در دسترس، محرک اصلی برای پژوهش در مورد اثر ورزش بر دستگاه ایمنی است. استفاده از ELISA به پژوهشگران اجازه سنجش دامنه گسترده­ای از مولکول­ها را می­دهد.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

روش ELISA بر اساس اصل ساندویچ پایه­ریزی می­ شود. ابتدا یک صفحه 96 چاهکی، با یک آنتی­بادی دستگیر ویژه مولکول مورد نظر پوشانده می­ شود (تمامی صفحات ELISA تجاری دارای چاهک­های منفرد، از پیش با آنتی بادی دستگیر ویژه پوشانده شده است). سپس نمونه مورد نظر، استاندارد­ها و نمونه­های کنترل به چاهک­های منفرد افزوده شده و سپس برای دوره زمانی مشخص انکوبه می­ شود که در این مدت، مولکول مورد نظر با آنتی­بادی دستگیر ویژه تسخیر می­ شود. به دنبال انکوباسیون، صفحه برای پاک کردن مولکول­های پیوند نیافته از چاهک­های صفحه، چندین بار شسته می­شوند. پس از آن آنتی بادی دوم که با یک آنزیم (مانند پراکسیداز) جفت شده است به هر چاهک افزوده می­ شود. آنتی بادی دوم یک اپی توپ ( اپی توپ جایگاهی روی یک مولکول بزرگ است که آنتی بادی­ها علیه آن ساخته شده و به آن متصل خواهد شد) متفاوت روی مولکول مورد نظر را که به وسیله آنتی بادی دستگیر شناسایی شده است تشخیص می­دهد. در دوره دوم انکوباسیون، آنتی بادی دوم جفت شده با آنزیم به مولکول مورد نظر که به آنتی بادی دستگیر متصل شده است می­پیوندد و ساندویچ کامل می­ شود. پس از چندین بار شستشو برای پاک کردن آنتی بادی دوم پیوند نیافته، یک سوبسترای رنگ­زای آنزیمی به هر چاهک افزوده می­ شود. واکنش آنزیم با سوبسترای خود، سوبسترا را به محصول تبدیل می­ کند که موجب تغییر رنگ می­ شود. بنابر­این هر چه حضور آنزیم بیشتر باشد ( یعنی هر چه تعداد مولکول­های مورد نظر پیوندی با آنتی بادی دستگیر بیشتر باشد) پررنگ­تر می­ شود. برای تعیین کمیت مولکول­های مورد نظر در هر چاهک، میزان جذب (که خاموشی یا چگالی نوری نیز نامیده می­ شود) در یک طول موج ویژه روی میکروپلیت ریدر تعیین می­ شود. سپس منحنی استانداردی با بهره گرفتن از مجموعه ­ای از استاندارد­های با غلظت معین رسم شده و غلظت مولکول مورد نظر موجود در هر چاهک از منحنی کالیبراسیون اندازه ­گیری می­ شود.
ELISAابزاری بی­نهایت حساس، ویژه و سازگار است و می ­تواند برای سنجش بسیاری از مولکول­های بیولوژیکی مانند سایتوکاین­ها، هورمون­ها، مولکول­های چسبان، گیرنده­های محلول، پروتئین­های سیگنالیک درون سلولی و mRNA استفاده شود. در پژوهش­های ایمونولوژی ورزشی از ELISA بیشتر در سنجش سایتوکاین­ها استفاده می­ شود (گلیسون^[92]، 2007).
3-6- خونگیري و اندازه گیري پارامترها
در هر بار خونگیري میزان 6 میلی­لیتر خون از ورید بازویی گرفته شد. براي جلوگیري از همولیز شدن، نمونه­هاي خون در لوله­های حاویEDTA ریخته شده و به آرامی مخلوط شدند. سپس جهت جدا نمودن پلاسماي خون، نمونه­های خونی به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد با دور g 3000 در دقیقه سانتریفیوژ شد. پلاسمای جدا شده در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری شد، بعداً میزان اینترفرون گاما، اینترلوکین4 و تعداد لکوسیت اندازه­گیري شد. برای تحلیل نمونه­ها از کیت الایزا (ELISA) استفاده شد (گوخال، چاندراشکارا و واسانتاکومار^[93]، 2007).
3-7- روش اجراي تحقيق
یک هفته قبل از اجرای پژوهش، آزمودنی­ها با شرکت در یک جلسه آشنایی، با نحوه اجرای تمرین آشنا شدند. ابتدا شاخص­هايي چون سن، قد، وزن، شاخص توده­بدني^[94] (BMI) و همچنین ضربان قلب استراحت آزمودني­ها اندازه ­گیری شد. ضربان قلب بيشينه آزمودني­ها نيز برای تعیین شدت­های مختلف تمرین محاسبه گردید.
برای تعیین شدت فعالیت ورزشی، ابتدا ضربان قلب هدف هر ورزشکار به روش کاروونن^[95] محاسبه شد (هوانلو و همکاران ،2009).
ضربان قلب بیشینه به روش کاروونن:
HR _target = % Intensity (HR _max – HR _rest)+ HR _rest
در فرمول فوق:
HR_target = ضربان قلب بیشینه
HR_max = ضربان قلب بیشینه تخمینی (که با کسر کردن سن فرد از عدد 220 بدست می ­آید)
HR _rest = ضربان قلب فرد در وضعیت استراحت
هر آزمودنی با نظارت محقق ضربان قلب خود را در محدوده مورد نظر حفظ کرد، به این ترتیب که اگر ضربان قلب از محدوده مورد نظر بیشتر شد آزمودنی سرعت خود را کم کرده تا ضربان پایین آمده و در محدوده مورد نظر حفظ شود و اگر ضربان پایین­تر از حد انتظار آمد آزمودنی با افزایش سرعت دویدن، ضربان را به حد مطلوب می­رساند.
آزمودنی­ها در دو نوبت جداگانه و به فاصله يك هفته از هم، پروتکل تمرینی را با شدت­های مختلف اجرا كردند.
كليه آزمودني‌ها، رأس ساعت 7:15 صبح، از محل سكونت، با وسيله نقليه به آزمایشگاه جهت خونگیری پیش از آزمون منتقل شده و نمونه خون از ورید بازویی آنها گرفته شد و سپس به محل اجراي آزمون (ورزشگاه تختی جهرم) عزيمت نمودند.
آزمودني­ها در هفته اول با شدت متوسط يعني با 65% ضربان قلب بيشينه و در هفته دوم با شدت زیاد يعني با 80% ضربان قلب بيشينه، به اجراي آزمون پرداختند. لازم به ذكر است آزمودني­ها درست قبل از شروع آزمون به مدت 5 دقيقه به گرم كردن پرداختند به طوري كه بعد از 5 دقيقه به ضربان قلب مورد نظر براي انجام آزمون رسیدند و سپس به مدت 30 دقيقه با شدت مورد نظر دویدند و پس از اتمام آزمون نيز به مدت 5 دقيقه با كم كردن سرعت دویدن سرد کردند (شکل 3-1). در طول اجراي پروتكل تمريني، آزمودني­ها مجاز به مصرف مايعات بودند (ویگرانس، هاستمارک، استومی، کایرولف و بایرکلند^[96]، 2001). لازم به ذكر است كه در هر جلسه، دو بار از آزمودنی­ها خونگیری به عمل آمد:
الف) پيش از شروع تمرین، یعنی ده دقیقه قبل از شروع برنامه تمرینی
ب) بعد از تمرین، یعنی حداکثر ده دقیقه پس از اتمام برنامه تمرینی
نمونه­های خونی گرفته شده بلافاصله به آزمایشگاه منتقل شدند. اطلاعات مورد نیاز این پژوهش از طریق اندازه ­گیری فاکتور­های مورد نظر در خون داوطلبین، جمع­آوری شد.
نمونه­های خون از نظر موارد زیر، مورد بررسی قرار گرفتند:

• • اینترفرون گاما (IFN-γ)

• • اینترلوکین-4 (IL-4)

• • تعداد لکوسیت­ها

شكل 3-1 . اجراي پروتكل تمرين ( دويدن )
3-8- روش­های تجزیه و تحلیل آماری
داده ­ها با بهره گرفتن از نرم افزار آماری SPSS تجزیه و تحلیل شدند. از میانگین و انحراف معیار برای توصیف آماری داده ­ها و جهت تجزيه و تحليل استنباطي داده‌ها از آزمون t وابسته و تحليل واريانس با اندازه‌هاي تكراري استفاده و سطح معني­داري 05/0 = در نظر گرفته شد.
3-9- ملاحظات اخلاقي
رضايت آگاهانه به معني مطلع كردن شركت كنندگان در تحقيق از جنبه­هاي مختلف پژوهش است كه ممكن است منطقاً بر تصميم­گيري آنان به شركت كردن يا نكردن در پژوهش تاثير بگذارد (بیابانگرد، 1384).
پس از اطلاع كامل آزمودنی­‌ها از پروتكل اجرايي و خطرات و مشكلات احتمالي تحقيق، از هر يك از آزمودني‌ها رضايت نامه­كتبي دريافت شد كه نمونه آن به همراه پرسش­نامه شركت در طرح پژوهشي به ترتيب در پيوست (1) و پيوست (2) آورده شده است. هر يك از آزمودني‌ها در طول مطالعه مجاز به خروج آزادانه از مطالعه بود. كليه اطلاعات مربوط به آزمودني­ها، محرمانه باقي مانده و در طول تحليل نتايج، برای اسامي آزمودني‌ها، از كد استفاده گرديد.
فصل چهارم:
يافته­هاي پژوهش
مقدمه
اين فصل به بيان نتايج اندازه­گيري­هاي انجام شده در مورد آزمودني­ها، تجزيه و تحليل اطلاعات خام اين اندازه­گيري­ها و در نهايت آزمون سوالات طرح شده در فصل اول مي­پردازد.
ابتدا مشخصات عمومي آزمودني­ها به صورت توصيفي ارائه مي­شود. سپس در ادامه سوالات تحقيق از طريق شکل­هاي مربوط، توصيف و به كمك روش­هاي مناسب آماري تجزيه و تحليل استنباطي مي­شوند.
4-1- تجزيه و تحليل توصيفي داده ­ها
همان طور كه اشاره شد، آزمودني­هاي اين تحقيق را فوتبالیست­های جوان دانشگاهی تشكيل مي­دهند.
ويژگي­هاي فردي شامل سن، قد، وزن و BMI و همچنین متغییر­های مورد نظر یعنی اینترفرون گاما، اینترلوکین 4 و لکوسیت آزمودني­ها پيش از انجام آزمون، اندازه­گيري شد كه نتايج آن، با بهره گرفتن از روش­هاي آمار توصيفي در جداول زير خلاصه شده است.
درجدول (4-1)، ميانگين و انحراف معيار سن، قد، وزن و BMI آزمودني­ها ارائه شده است و در جدول (4-2)، ميانگين و انحراف معيار اینترفرون گاما، اینترلوکین 4 و لکوسیت آزمودني­ها قبل از اجرای پروتکل تمرینی ارائه شده است.
جدول (4-1). ميانگين و انحراف معيار سن ، قد، وزن و BMI آزمودني­ها