سولفات منیزیم
فسفات دی هیدروژن پتاسیم
PH محیط بین ۶/۵-۸/۵ تنظیم شد. ساکارز مصرفی برای کلیه محیط ها ۳۰ گرم در لیتر بوده است ، که فقط در مرحله ریشه دهی مقدار ساکاروز ۱۵ گرم در لیتر تغییر یافت. میزان آگار مصرفی نیز ۷ گرم در لیتر بوده است.
( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
روش تهیه گیاه پایه استریل
در این مرحله با بهره گرفتن از بذرهای گیاه رازیانه به روش زیر به گیاه پایه دسترسی پیدا شد
۳-۵- مراحل سترون سازی
۳-۵-۱- سترون سازی بذرها
به منظور حذف موجودات ریز همانند شتهها بذرها ابتدا در مجاورت آب جاری به مدت ۲۰ دقیقه قرار گرفته در گام بعد از دترجنت توئیین به منظور کاهش کشش سطحی به مدت ۷ دقیقه استفاده کرده و آنرا تکان میدهیم بعد از اتمام زمان مورد نظر بذور را از صافی عبور داده و بعد به وسیله آب مقطر استریل شستشو و در محلول هیپوکلریت سدیم با ۱درصد ماده مؤثره به مدت ۱۰ دقیقه همراه با تکان دادن قرار داده نمونه را در هود قرار داده در الکل ۷۰درصد به مدت ۳۰ ثانیه تکان داده شدند و بعد ۳ تا ۵ بار با آب مقطر استریل شده کاملأ شستشو شدند. این اعمال در اتاقک لامینارایرفلو صورت گرفت.
۳-۵-۲- سترون سازی محیط و وسایل کار
جهت کار کشت اندام و بافت گیاهی وجود مکانی عاری از آلودگی لازم و ضروری است در غیر این صورت محیط کشت دچار آلودگی شده و از بین می رود. برای ایجاد فضای سترون جهت انتقال بذرها و ریز نمونه ها ، از اتاقک لامینار ایرفلو استفاده شد. اتاقک لامینار ایرفلو جریان دائمی از هوای سترون شده در محیط کار ایجاد می کند. این دستگاه دارای صافی ریز با کارایی بالا (HEPA) با قطر منافذ حدود MM 2/0 است که باعث حذف باکتری ها و اسپور قارچ ها می شود. این اتاقک دارای منبع نور UV برای ضد عفونی کردن سطح محیط کار است که ۲۰-۱۵ دقیقه قبل از شروع کار روشن شده و هنگام کار با دستگاه ، منبع UV خاموش می شود . حداقل ۳۰ دقیقه قبل از شروع کار جریان هوای سترون شده به صورت دائمی برقرار می شود. سطح محیط کار قبل و بعد از استفاده با اتانول ۷۰ % ضد عفونی می شود (ایوانز[۶۹] ۱۳۸۵).
پس از ضد عفونی سطح اتاقک ، شیشههای حاوی محیط کشت و لوازم مورد نیاز جهت انتقال بذر یا ریز نمونه به زیر هود منتقل شد. پنس ، اسکالپل و پتریدیش در دمای ۱۲۱ درجه به مدت ۱۵ تا ۲۰ دقیقه اتوکلاو می نمائیم و بلافاصله آنها را به زیر هود منتقل کردیم. پس از انتقال به زیر هود پنس و اسکالپل را درون شیشه حاوی الکل ۷۵ % قرار داده شد. وسیله ی آغشته به الکل را قبل از استفاده روی شعله گرفته و صبر نموده تا قبل از استفاده سرد شود. (اسمیت[۷۰] ۱۳۸۱).
۳-۵-۳- تولید گیاهان سترون جهت تیمارهای مختلف
از آنجا که هدف از این پژوهش بررسی اثر غلظتهای مختلف هورمونها بر روند رشد گیاه وتهیه سوسپانسیون از این گیاه باشد لذا تولید گیاهچههای سترون حاصل از مرحله اول ضروری است. بذرها در محیط کشت MS فاقد هورمون و در دمای ۲۳ درجه سانتی گراد در ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی قرار داده شدند.
بعد از ۴ روز بذرها جوانه زده و بعد از گذشت ۲۱ روز از زمان کشت بذر گیاهچه های تازه جوانه زده آماده برای تهیه ریزنمونه بودند. در گام بعدی به منظور افزایش گیاهچههای مورد نظر تحت تیمار BAP با غلظتهای ۰.۵ و ۱ قرار گرفتند.
۳-۶- کشت گیاه در محیط های تیماری به منظور کالزایی
در مرحله اول از MSحاوی هورمونهای ۲,۴-D به همراه BAP وkin به همراه NAA به میزان تعیین شده در جدول استفاده شد. پس از افزودن ساکارز ۳% و تنظیم PH به میزان ۵/۵-۷/۵ مقدار۷.۵ گرم آگار در لیتر به محیط کشت اضافه شد سپس محیط کشت در شیشههای مخصوص کشت گیاهی به میزان مشخص (۴۰ میلی لیتر) توزیع شد و درگام بعد به همراه وسایل کشت از قبیل پنس و اسکالپل استریل شد. از ساقه و برگ و ریشه به عنوان ریز نمونه استفاده شد. بررسی کالزایی با آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملأ تصادفی با ۴ تکرار انجام شد. در هر شیشه ۵ ریزنمونه قرار داده و هر شیشه به منزله یک تکرار قلمداد شد. در نهایت {۴(ریزنمونه) *۱۶(سطح هورمونی) * ۳ (تکرار)} تهیه شد. صفات اندازه گیری شده در فاز کالزایی عبارت است از :
۱. درصد کالزایی
۲. وزن کالوس
۳. اندازه کالوس
جدول ۳-۱. ترکیب و غلظتهای هورمونی مورد استفاده در القاء و رشد کالوس در محیط MS
ردیف
نام تیمار
نوع و مقادیر هورمون
۱
A1
۱ میلی‌گرم در لیتر۲,۴-D+1 میلی‌گرم در لیترBAP
۲
A2
۲ میلی‌گرم در لیتر۲,۴-D+1 میلی‌گرم در لیترBAP
