۲-۱۵-۱ اجزای واکنش زنجیره‌ای پلیمراز(PCR)
این روش در اواســـــط دهــــه ۱۹۸۰ به وسیـــــله کری مولیس معرفی شد. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز مبتنی بر همانند‌سازی نیمه حفاظت شده DNA می‌باشد. در این واکنش قطعه‌ای از DNA بین دو ناحیه با توالی شناخته شده تکثیر می­‌شود. تکثیر به وسیله دو توالی الیگونوکلئوتیدی به عنوان آغازگر که به دو رشته DNA و در ناحیه مکمل خود متصل می‌شوند صورت می‌گیرد (Chawla, 2002). اجزای تشکیل دهنده این واکنش به شرح زیر است.
۲-۱۵-۲آغازگر
آغازگرهای PCR، الیگووکلئوتیدهایی هستند که بر روی رشته الگو به توالی‌های مکمل خود متصل می‌شوند و حدود محصولات تکثیر را مشخص می‌کنند. هنگام طراحی آغازگرها عوامل متعددی مانند پرهیز از مکمل بودن توالیهای درون یک آغازگر و یا بین آغازگرها، محتوی GC آغازگر، طول آغازگرها و دمای ذوب ™ آغازگر مورد توجه قرار می‌گیرد. دمای ذوب، درجه حرارتی است که در آن نیمی از آغازگرها به جایگاه هدف اتصال پیدا کرده باشند. دمای ذوب آغازگر در انتخاب دمای اتصال اهمیت دارد و معمولاً دمای اتصال چند درجه کمتر از دمای ذوب انتخاب می‌شود (Dawson, 1998).
۲-۱۵-۳ آنزیم
مهم‌ترین ویژگی آنزیم مورد استفاده در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، مقاومت به حرارت می‌باشد. آنزیمی که به طور معمول در PCR استفاده می‌شود، آنزیم تـــــک DNA پلیمراز می‌باشد که از باکتری گرمادوست Thermus aquaticus استخراج می‌شود. این آنزیم فاقد فعالیت اگزونوکلئازی َ۳ به َ۵ بوده و قادر به تصحیح بازهای اشتباه نمی‌باشد. آنــزیم اضافه در واکنش سبب تکثیر توالی‌های غیرهدف می گردد Mcpherson M. and S. G. Moller2000))
۲-۱۵-۴الگو
نمونه مورد استفاده جهت تکثیر در PCR ممکن است DNA تک رشته و یا دو رشته­ای حیوانات، گیاهان و حتی باکتری­ ها باشد. مولکول های RNA شامل RNA کل، و یا tRNA نیز می توانند بعد از این­که توسط آنزیم ترانس‌کریپتاز معکوس بهDNA مکمل(cDNA) تبدیل شدند، به عنوان الگو برای تکثیر مورد استفاده قرار گیرند Dawson , M.T.,A.Powell and F ,1998).)

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۲-۱۵-۵ دزاکسی ریبونوکلئوزید تری‌فسفات‌ها
در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز مرسوم، هرچهار نوع دزاکسی ریبونوکلئوزید تری‌فسفات با غلظت‌های مساوی به کار برده می‌شوند. غلظت مناسب dNTPs به عوامل متعددی مانند طول رشته مورد نظر، غلظت آغازگر، غلظت MgCl₂ و تعداد سیکل‌های تکثیر بستگی دارد. جهت بهینه‌سازی یک واکنش ضروری است که بهترین غلظت به صورت عملی تعیین شود.
۲-۱۵-۶کلرید منیزیم
کلرید منیزیم (MgCl₂) یک عنصر اساسی برای تکثیر DNA در واکنش PCR می باشد زیرا یون Mg²⁺ با dNTPs کمپلکسی تشکیل می دهد که برای وارد کردن dNTP در رشته ضروری است. به علاوه، این یون از طریق تحریک فعالیت پلیمرازی، واکنش متقابل آغازگر – الگو را افزایش می‌دهد. غلظت MgCl₂ باید برای هر جفت الگو– آغازگر بهینه شود. معمولاً غلظت پایین یون Mg²⁺ باعث کاهش محصولات PCRو غلظت زیاد آن منجر به تجمع محصولات غیراختصاصی می‌شود.
۲-۱۵-۷ بافر
بافر موردنیاز برای فعالیت آنزیم تک‌ پلی­مراز در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز شامل ۵۰ mM KCl، Tris-HCL 10 mM و Gelatin 1% pH 8.3 می‌باشد. قابل ذکر است که در صورت استفاده از سایر آنزیم‌های پلیمراز مقاوم به حرارت، ترکیبات بافر متفاوت خواهد بود (McPherson, 2000).
۲-۱۵-۸ مراحل تکثیر
در هر چرخه واکنش ابتدا توسط حرارت پیوندهای هیدروژنی دو رشته DNA شکسته شده و رشته‌ها از هم باز می‌شوند. جداشدن رشته‌ها معمولاً در دمای ^oC94 صورت می‌گیرد و واسرشته‌سازی نام دارد. سپس مخلوط واکنش سرد می‌شود تا آغازگرها به نواحی مکمل خود متصل شوند. این مرحله که به طور معمول در دمای ^oC65-35 انجام می‌گیرد، مرحله اتصال نامیده می‌شود. در مرحله سوم که دما حدود ^oC72 بوده و بسط نام دارد آنزیم پلیمراز از روی DNA الگو همانند سازی کرده و بسط یک ناحیه از DNA صورت می‌گیرد. نکته مهم در این چرخه، دمای واکنش در مرحله اتصال آغازگر است. دما برای اتصال تدریجی باید به حد کافی پائین باشد تا امکان دورگه‌گیری بین آغازگر و الگو وجود داشته باشد و از طرفی به حد کافی بالا باشد تا از تشکیل دورگه‌های اشتباه جلوگیری کند (Chawla, 2000).
۲-۱۶ درخت فیلوژنتیک
بررسی فیلوژنتیکی یک خانواده بر اساس ترادف اسید نوکلئیک یا پروتئین تعیین می­ کند که چه­ طور یک خانواده در مسیر تکاملی خویش از اجداد اولیه خود مشتق شده ­اند. ارتباطات تکاملی در میان ترادف­ها توسط مکان یا رتبه ترادف­ها که به عنوان شاخه­ های بیرونی یک درخت می­باشند نمایش داده می­ شود. ارتباطات بین شاخه­ای در بخش داخلی درخت منعکس کننده درجه­ای است که ترادف­های متفاوت را که با هم ارتباط دارند را نمایش می­دهد. دو ترادف که همانندی خیلی زیادی با هم دارند به صورت شاخه­ های بیرونی مجاور واقع خواهند شد و به یک شاخه مشترک (معمولی) که در زیر آن­ها واقع شده متصل می­شوند. هدف از بررسی فیلوژنتیکی پیدا کردن ارتباطات بین شاخه­ های درخت و طول شاخه­ها می­ باشد. بررسی فیلوژنتیکی ترادف­های پروتئین و اسید نوکلئیک در حال حاضر وجود دارد و به صورت ناحیه مهمی از آنالیز ترادفی ادامه خواهد یافت. وقتی یک ژن خانوادگی در یک موجود زنده کشف شود، ارتباطات فیلوژنتیکی در میان ژن­ها می ­تواند به پیشگویی این که یکی از آن­ها ممکن است یک عملکرد مشابه داشته باشد کمک کند. که این پیشگویی­های کاربردی می ­تواند به وسیله آزمایشات ژنتیکی بررسی شوند. بررسی فیلوژنتیکی در دنبال کردن تغییراتی که به وقوع می­پیوندند در گونه ­هایی که به سرعت تغییر می­ کنند، مانند یک ویروس می­توانند استفاده شوند.
برنامه ­های بررسی فیلوژنتیکی زیادی در دسترس می­باشند که هزینه کمی دارند و یا هزینه­ای ندارند. از مهم ترین این برنامه­ ها که مورد استفاده قرار می­گیرد برنامه ­های PHYLIP و PAUP می­باشند. نسخه­های جدید از این برنامه­ ها ۳ روش اصلی را برای بررسی فیلوژنتیکی شامل Parsimony, Distance, Maximum likelihood را فراهم کرد و هم­چنین تعداد زیادی از مدل­های تکاملی را برای درجه تنوع ترادف را شامل می­ شود. برنامه دیگر MacClade می­باشدکه برای آنالیزهای با جزئیات بیشتر مفید است.
فصل سوم
مواد و روش ها
۳-۱مطالعه منابع
ابتدا به مطالعه منابع موجود در اینترنت و کتب مرجع جهت مطالعه مقالات بررسی تحقیقاتی که اخیراً صورت گرفته و تعیین چارچوب کاری پرداخته شد از فلور ایران Khatamsaz,2002)) و به عنوان شناسایی نمونه های هر بار یومی و بررسی صفات کیفی و کمی ریخت شناسی استفاده گردید.
نمونه برداری از آنجایی که محدوده پراکنش گونه ها وسیع بود و همچنین به علت عدم وجود امکانات و زمان کافی برای جمع آوری به موقع گیاهان بخش عمده بر روی نمونه های هر بار یومی انجام گرفت.
.
۳-۲مطالعه هر بار یومی
استفاده ازDNA در سیستماتیک مولکولی داده های مولکولی مخصوصاً توالی DNA برای بازسازی روابط فیلوژنی نسبت به سایر روش های دیگر از صحت بیشتری برخوردار است به همین دلیل امروزه به خصوص از زمان پیدایش واکنش زنجیره ای پلیمراز این روش با استقبال محققین مواجهه شده است (Chase et al. ,۱۹۹۳).
۳-۳استفاده از DNA در سیستماتیک مولکولی
در گیاهان ۳ نوع اصلی از توالی های DNAدر دسترس است که عبارتند از:توالی های هسته ای (nr DNA)، توالی های کلروپلاستی (cp DNA) و توالی میتوکندر یایی. توالی میتوکندر یایی به علت سرعت تکاملی پایین کمتر در بررسی روابط خویشاوندی گیاهان مورد استفاده قرار می گیرند.
اما توالی های کلروپلاستی و هسته ای در ابعاد وسیعی بدین منظور به کار می روند (معین، ۱۳۸۹).
(Internal Transcribed spacer) ITS یا ناحیه فاصله گذار رونویسی شونده درونی بخش از ریبوزومی هسته می باشد (شکل۱-۵) درون این ناحیه، نواحی کد گذار بسیار حفاظت شده
, ۲۶snrDNA) (18nrDNA,5,8 snrDNAبه همراه نواحی غیر کد گذار (ETS و ITS)قرار دارند. نواحی ITS1 و ۲ ITS در بالغ شدن و پردازش ریبوزوم نقش مهمی را ایفا می کنند اما ناحیهITS پس از پردازش ریبوزوم ترجمه نمی شود و به همین علت کمتر تحت فشار عملکردی است. و سرعت بالای تکاملی، این ناحیه را برای بررسی روابط فیلوژنتیکی مناسب کرده است (Baldwin et al. ,1995,Alvarez &vendel ,2003)
شکل ۱-۵ ساختار ناحیه - شکل ۲ nrDNA ITS برگرفته از Baldwin et al.,1995 با اندکی تغییر

دهه اخیر از داده های توالی ITS به عنوان ابزاری برای تعیین روابط فیلوژنتیکی در سطح پائین تاکسونومی و مخصوصاً جنس های نزدیک استفاده شده است (۲۰۰۸،. Soltis et al)
دلایل استفاده از این ناحیه در بازسازی روابط فیلوژنی را می توان به صورت زیر بیان کرد:
۱-دارای کپی های فراوان که به صورت تکرار های در یک یا چند لوکوس کروموزومی ژنوم هسته ای قرار گرفتند که سبب سهولت در تکثیر کلونینگ و توالی یابی آن می شود.
۲-یکی از مهمترین ویژگی های این ناحیه برای بازسازی روابط فیلوژنی وجود تکامل هماهنگ در این منطقه از طریق کراسیگ اوور نابرابر و برابر می باشد.
۳- اندازه کوچک این ناحیه (کمتر از ۷۰۰ جفت باز در نهاندانگان) و حضور توالی های بسیار حفاظت شده در مجاورت آن، سبب سهولت در تکثیر این ناحیه حتی از نمونه های هر بار یومی می شود.
White و همکاران (۱۹۹۰) پرایمرهای همگانی برای تکثیر این قطعه در موجودات یوکاریوت طراحی کردند.
۴- برتری این ناحیه نسبت به ژنوم کلروپلاستی در به ارث رسیدن از دو والد است که این ویژگی سبب می شود تا درصد هیبرید ها و پلی پلوئیدی ها را نیز تشخیص داد (Baldwin et al. ,1995).
عمومیت این ژن در تمامی نهاندانگان، مزیت آن برای استفاده از گیاهان انگل است که بخشی یا تمامی کلروپلاست خود را از دست داده اند (معین، ۱۳۸۹).
۳-۴بررسی روابط فیلوژنی بر اساس صفات مولکولی
به منظور بررسی و بازرسانی تاریخچه تکاملی قبیله Cynoglosseae از توالیهای هسته ای
nrDNAITS (Nuclear Ribosomal DNA Internal Tran cribed spacer)
استفاده شد تاکسونهای مورد بررسی در این مطالعه در جدول آورده شده است
۱-۳ تاکسون های مورد استفاده برای تکثیر قطعه - جدول nrDNA ITS