آنزیم‌های بتالاکتاماز در باکتریها بسیار متنوعند و در پاسخ به فشار انتخابی آنتی بیوتیک، دائماً در حال موتاسیون و یا جایگزینی اسیدهای آمینه به ویژه در جایگاه فعال آنزیم هستند به طوریکه باعث ظهور انواع جدیدی از بتا لاکتامازهای با طیف گسترش یافته (ESBL) شده است [۷۱].
بیش از ۱۵۰ نوع ESBL از کشورهای مختلف گزارش شده است که غالباً باکتریهای انتروباکتریاسه مولد آن هستند [۷۲].
بتالاکتامازهای با طیف وسیع آنزیمهایی هستند که علاوه بر ایجاد مقاومت به پنیسیلینها، واسطه ایجاد مقاومت به طیف وسیعی از سفالوسپورینهای نسل سوم مثل سفتازیدیم، سفوتاکسیم، سفتریاکسون و مونوباکتامها مثل آزترئونام محسوب میشوند .بر خلاف موارد بالا معمولاً مقاومت نسبت به سفامایسینها مثل سفوکسیتین و سفوتتان و نیز کارباپنمها مثل ایمیپنم و مرپنم در این دسته باکتریها مشاهده نمیشود. عوامل بازدارنده بتالاکتامازها مانند کلاولانیک اسید، سولباکتام و تازوباکتام اثر بازدارندگی بر عملکرد این آنزیمها دارند [۷۳].
E.coli، K.pneumoniae ، K.oxytoca، Proteus mirabilis ، Enterobacter cloacae ، Morganella morganii ، Serratia marcescens ، Burkholderia cepacia ، Capnocytophaga ochracea ، Acinetobacter ، گونه‌های Citrobacter و Salmonella از جمله باکتری‌هایی‌هایی هستند که تولید این نوع از بتا لاکتامازها در آنها مشاهده شده است [۷۵، ۷۴].
درمان عفونتهای حاصل از باکتریهای مولد این آنزیمها بغرنج است چون از یک سو مقاومت به طیف وسیعی از سفالوسپورینها مشاهده میشود و از سوی دیگر بسیاری از ژنهای ESBL به روی پلاسیمدهای بزرگی) بیش از ۱۰۰ کیلوباز) قرار دارد که همزمان حامل ژنهای مقاومت به سایر عوامل ضدمیکروبی مثل آمینوگلیکوزیدها، کلرامفنیکل، سولفونامیدها و تتراسایکلین نیز است . این عفونتها دارای رابطه معنی داری با میزان مرگ و میر بیماران است و بار مالی زیادی را در پی دارد [۷۶].
این پلاسمیدهای کونژوگاتیو به راحتی میتوانند از یک سویه به سویه ی دیگر و یا حتی به گونه‌های دیگری منتقل شوند [۷۷].
از آنجائیکه وجود مقاومت وابسته به ESBLs در مناطق مختلف جهان متفاوت بوده و سویه‌های دارای ESBLs در شرایط vivo in علاوه بر آنتی بیوتیکهای بتالاکتام به گروه های دیگر آنتی بیوتیکی نیز مقاومت نشان می‌دهند بر آن شدیم تا شیوع ESBLs را در سویه‌های کلبسیلا در بخش‌های مختلف در بیمارستان‌های شهر یزد مورد بررسی قرار داده تا با بهره گرفتن از نتایج بدست آمده و در صورت وجود شیوع زیاد جهت تعیین روتین ESBLs روش DDST را در نمونه‌های بالینی رایج نمائیم.
۲-۲- اهداف
۲-۲-۱- اهداف اصلی طرح
فراوانی آنزیم بتالاکتاماز با طیف گستردش یافته ( ESBLs) در کلبسیلا پنومونیه جدا شده از بیماران بستری در بیمارستان‌های شهر یزد بروش Double Disk Synergy Test
۲-۲-۲- اهداف ویژه طرح

1. 1. فراوانی نسبی آنزیم ESBLs در سویه‌های کلبسیلا پنومونیه.

1. 1. فراوانی نسبی آنزیم ESBLs در سویه‌های کلبسیلا پنومونیه بر حسب نوع نمونه.

1. 1. فراوانی نسبی آنزیم ESBLs در سویه‌های کلبسیلا پنومونیه بر حسب بخش.

1. 1. فراوانی نسبی آنزیم ESBLs در سویه‌های کلبسیلا پنومونیه بر حسب سن.

1. 1. فراوانی نسبی آنزیم ESBLs در سویه‌های کلبسیلا پنومونیه بر حسب جنس.

1. 1. فراوانی نسبی مقاومت سویه‌های کلبسیلا پنومونیه به آنتی بیوتیک‌های مختلف به روش دیسک دیفیوژن.

1. 1. فراوانی نسبی آنزیم ESBLs در سویه‌های کلبسیلا پنومونیه بر حسب وضعیت مقاومت به آنتی بیوتیک های مختلف.

۲-۳- سؤالات و فرضیات

1. 1. فراوانی نسبی آنزیم ESBLs در سویه‌های کلبسیلا پنومونیه متفاوت است.

1. 1. فراوانی نسبی آنزیم ESBLs در سویه‌های کلبسیلا پنومونیه بر حسب نوع نمونه متفاوت است.

1. 1. فراوانی نسبی آنزیم ESBLs در سویه‌های کلبسیلا پنومونیه بر حسب بخش متفاوت است.

1. 1. فراوانی نسبی آنزیم ESBLs در سویه‌های کلبسیلا پنومونیه بر حسب سن متفاوت است.

1. 1. فراوانی نسبی آنزیم ESBLs در سویه‌های کلبسیلا پنومونیه بر حسب جنس متفاوت است.

1. 1. فراوانی نسبی مقاومت سویه‌های کلبسیلا پنمونیه در آنتی بیوتیک‌های مختلف متفاوت است.

1. 1. فراوانی نسبی آنزیم ESBLs در سویه‌های کلبسیلا پنومونیه بر حسب وضعیت مقاومت به آنتی بیوتیک های مختلف متفاوت است.

۲-۴- نوع و روش مطالعه
مطالعه از نوع توصیفی – تحلیلی بود که به روش مقطعی می باشد که با بهره گرفتن از روش سرشماری، تمام نمونه‌ها مشتمل بر K.pneumoniae جمع آوری شده از بیمارستان‌های شهید صدوقی و شهید رهنمون و سوانح سوختگی استان یزد مورد ارزیابی قرار گرفتند.
جامعه مورد بررسی و خصوصیات افراد مورد مطالعه:
جامعه مورد بررسی کلیه سویه‌های K.pneumoniae به دست آمده از بیماران بستری در بیمارستان‌های شهید صدوقی و شهید رهنمون و سوانح سوختگی استان یزد می باشد که بین اسفند ۹۱ تا اسفند ۹۲ جمع آوری شده اند.
۲-۵- روش کار
۲-۵-۱- محیط مورد استفاده جهت کشت باکتری
ائوزین متیلن بلو EMB(Eosin methylene-blue agar):
این محیط کشت محیط افتراقی- انتخابی مفیدی در جداسازی و شناسایی باکتری‌های روده ای گرم منفی است. رنگ‌های ائوزین y و متیلن بلو، اجزاء انتخابی هستند که افزوده شده اند تا در حالی که به باکتری‌های گرم منفی اجازه رشد می دهند از رشد باکتری‌های گرم مثبت جلوگیری کنند. کربوهیدرات‌های لاکتوز و سوکروز برای این که ایزوله‌ها را بر اساس تخمیر لاکتوز و ساکاروز تفکیک کنند، اضافه شده اند. تخمیر با تغییر رنگ و رسوب رنگ‌های افزوده شده، در اثر افت PH، مشخص و ارزیابی می شود.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

E.Coli یک کلی فرم تخمیر کننده لاکتوز است که به طور شاخص و تیپیک، کلونی‌های آبی-سیاه با درخشندگی فلزی متمایل به سبز ایجاد می کند. دیگر کلی فرم‌های تخمیر کننده مثل Enterobacter و Klebsiella ، کلونی‌های صورتی تشکیل می دهند. کلونی‌های غیر تخمیر کننده شفاف، کهربایی رنگ یا بی رنگ هستند[۷۸].
۲-۵-۲- محیط کشت‌های مورد استفاده جهت تعیین هویت باکتری
سیمون سیترات آگار(Simmons Citrate agar):
برای تعیین قدرت باکتری در استفاده از سیترات به عنوان تنها عامل کربن دار موجود در محیط می باشد. باکتری‌های که قادر به رشد در این محیط باشند؛ در حقیقت توانسته اند از سیترات که تنها عامل کربن دار در محیط است؛ استفاده کنند. در نتیجه در مجاورت معرف رنگی بروموتیمول بلو به رنگ آبی در می آیند. در غیر این صورت به علت عدم رشد باکتری و عدم تغییر رنگ محیط آزمایش سیترات منفی است.
باکتری‌های که قادراند سیترات را به عنوان تنها منبع کربن و منبع انرژی و نمک آمونیوم را به عنوان تنها منبع ازت جهت رشد خود به کار برند قادرهستند محیط سیمون سیترات که حاوی معرف بروموتیمول آبی(سبز رنگ) است؛ را به رنگ آبی تبدیل کنند.
روش کار
باکتری را در محیط سیمون سیترات که به صورت سطح شیب دار است کشت داده و در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۲۴ ساعت نگهداری شد. در صورتی که رنگ سبز اولیه به رنگ آبی تبدیل شود؛ واکنش مثبت است(مثل Klebsiella) رنگ سبز نشان منفی بودن واکنش است [۷۸].
محیط کشت متیل رد-وژوسپروسکار MR-VP(Methylred-Vegesproskaure broth):
این محیط ملاک آزمایشی می باشد برای تفکیک مسیرهای تخمیر گلوکز و نهایتا ایجاد ترکیبات اسیدهای الی مختلف و یا تولید بوتاندیول یا بوتیلن گلیکول بوده که از این آزمایش در تفکیک و تشخیص کلی فرم‌ها از هم مورد استفاده قرارمی گیرد.
آزمایش MR: پس از انجام کشت و انکوباسیون در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۴۸ ساعت، مقدار ۵/۰ میلی لیتر معرف رنگی متیل رد اضافه نموده و در صورت ظهور رنگ قرمز آزمایش MR مثبت می باشد. در صورت پیدایش رنگ نارنجی آزمایش MR مثبت ضعیف می باشد و در صورت عدم تغییر و پایداری رنگ زرد آزمایش MRمنفی می باشد.
نتیجه
ظهور رنگ قرمز: آزمایش مثبت(PH=4/4)
ظهور رنگ نارنجی: آزمایش مثبت ضعیف(PH=5/3)
ظهور رنگ زرد: آزمایش منفی(PH بیشتر از ۳/۵)
آزمایش VP: به لوله کشت داده شده و انکوبه شده حدود ۶/۰ میلی لیتر معرف آلفا نفتول(معرف A)و مقدار ۲/۰ میلی لیتر محلول پتاس (معرف B)اضافه کرده و خوب تکان می دهیم. اگر تغییر رنگ صورت نگرفت آن را به مدت ۳۰ دقیقه به حال خود گذاشته و در صورتی که ظهور رنگ صورتی تا قرمز پدیدار شود، آزمایش VP مثبت و اگر تغییر رنگی صورت نپذیرد، آزمایش VP منفی خواهد بود[۷۸].
نتیجه