جنین­های غیرجنسی یا مستقیما بر روی ریزنمونه ظاهر می­شوند(جنین زایی مستقیم) یا غالبا از کشت کالوس­ها بوجود می­آیند (جنین زایی غیرمستقیم). این روش از نظر حفظ ثبات ژنتیکی صددرصد تایید شده نیست، هر چند جنین­زایی غیرجنسی در کشت سلولی جهت توسعه و پیشرفت تکنولوژی تولید انبوه بوسیله راکتورها و هم­چنین در تولید بذر سنتزی از طریق کپسوله کردن بسیار مفید واقع می شود. بنابراین، این روش زمانی که استاندارد خیلی بالایی در ثبات ژنتیکی مد نظر نیست می ­تواند مورد استفاده قرار بگیرد. سلول­های گیاهی دارای خاصیت توتی پوتنسی هستند یعنی می­توانند یک گیاه کامل جدید را تحت شرایط مطلوب تولید کنند. استوارد^[۴۱] و همکارانش در امریکا و رینرت^[۴۲] در آلمان تقریبا بطور همزمان برای اولین بار تشکیل جنین غیرجنسی در کشت سوسپانسیون سلولی هویج را در سال ۵۹- ۱۹۵۸ گزارش کردند. این جنین های غیرجنسی در رشد و ساختار مشابه جنین های جنسی بودند(شکل ۱-۴).
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

شکل ۱-۴ مراحل رشد جنین­های جنسی و غیرجنسی
این جنین­های غیرجنسی از نظر مورفولوژیکی به ترتیب مراحل زیر را طی می­ کنند: کروی، قلبی و اژدری. از ظهور لپه­ها می­توان به تفاوت مرحله لپه­ای بالغ و جنین مرحله قلبی/ اژدری پی برد. در مرحله اژدری تمایز سلولی منجر به تشکیل مریستم ساقه و ریشه می­ شود. جنین­زایی یک روند دو مرحله­ ای می­باشد. اولین مرحله، القا جنین­زایی و دومین مرحله رشد جنین می­باشد که در نهایت منجر به جوانه زدن می­ شود. نیازهای القا جنین و رشد جنین متفاوت هستند بنابراین محیط­های متفاوتی برای هر مرحله به­کار می­رود (مارتینز رویز و همکاران، ۲۰۰۲ )^[۴۳]. چهار مرحله را توصیف می کند: القا، رشد اولیه، بلوغ جنین و جوانه زدن. این مراحل از نظر ساختار مورفولوژیکی و هم­چنین در نیازهای فیزیکی- شیمیایی تفاوت دارند.
۱-۲۸- کشت مریستم
مریستم­ها را بر اساس خصوصیاتی از جمله محل استقرار، منشاء، نوع بافتی که ایجاد می­ کنند، ساختمان سیتولوژیکی و سرانجام رشد و تمایز، تقسیم بندی می­ کنند. براساس محل استقرار، مریستم­ها را به سه گروه تقسیم بندی می­ کنند:

• • مریستم­های انتهائی که در رأس ساقه و یا نوک ریشه قرار دارند.

• • مریستم­های جانبی که به موازات سطح اندامِ محل استقرار خود، تمرکز می­یابند.

• • مریستم­های بین سلولی یا مریستم­های بینابینی که در پهنه بافت­های دیگر مستقر می­شوند (نجاحی، ۱۳۷۰).

۱-۲۹- باززایی
باززایی گیاهان از یک سلول یا اندام گیاهی از قابلیت های کشت بافت است که با کشف هورمون­های گیاهی امکان­ پذیر گردید. توانایی باززایی گیاه از یک سلول منفرد برای دست­ورزی ژنتیکی موجودات حائز اهمیت است. در گیاهان امکان باززایی یک گیاه کامل از یک سلول منفرد وجود دارد و این نوعی تکثیر غیر جنسی در گیاهان محسوب می­ شود. علاوه بر این، کشت بافت برای مطالعات پایه­ای در سلول­های حیوانی و گیاهی و دست­ورزی میکروارگانیسم­ها حائز اهمیت می­باشد.(شارما و همکاران^[۴۴]، ۲۰۰۰)
۱-۳۰- باززایی گیاهان کشت شده
اغلب هدف نهایی هر نوع کشت سلولی، باززایی گیاهان مورد نظر است، برخی گیاهان به خوبی در شرایط درون شیشه ­ای باززایی می­شوند و برخی دیگر مشکل دارند. درصد باززایی در گیاهان بسته به گونه گیاه، شرایط محیط و ترکیبات هورمونی متفاوت است. باززایی به دو روش مستقیم و غیر مستقیم صورت می­گیرد. در روش مستقیم ابتدا بافت­های مریستمی کشت شده و سپس از اندام­زایی مستقیم (شاخه­زایی و ریشه­زایی) برای باززایی گیاهان استفاده می­ شود. در این نوع کشت، شاخه­ های فراوانی از بافت ریزنمونه بدون واسطه کالوس تولید می­ شود. در روش باززایی غیر مستقیم عموماً تولید گیاهان با واسطه کالوس صورت می­گیرد. یعنی ابتدا بافت ریزنمونه وادار به تشکیل کالوس می­ شود و سپس از کالوس اندام­زایی صورت می­گیرد. مسیر دیگری برای باززایی گیاهان از کالوس، تولید اجسام شبه جنینی در بافت کالوس است که این فرایند جنین­زایی سوماتیکی نامیده می­ شود. در صورتی که هورمون اکسین از محیط کشت حذف شود، برخی سلول­های کالوس به حالت مریستمی در آمده و تولید اجسام شبه جنینی را می­ کنند. این جنین­ها به علت اینکه از بافت­های سوماتیکی منشاء می­گیرند، به عنوان جنین­های سوماتیکی شناخته می­شوند. این جنین­های نابجا قابل انتقال به محیط مناسب بوده و گیاه کامل را تولید می­ کنند(شریفی و همکاران، ۱۳۸۹).
۱-۳۱- مراحل ریزازدیادی از طریق کشت درون شیشه ­ای
به طور معمول ۴ مرحله جهت تکثیر درون شیشه ­ای گیاهان مدنظر است که شامل استقرار در محیط کشت، ایجاد شاخساره و پرآوری و تکثیر انبوه از طریق واکشت­های متوالی و در نهایت ریشه­زایی گیاهچه­های تولید شده و سازگار کردن آنها با شرایط گلخانه و بیرون می باشد
۱-۳۲- استقرار در محیط کشت
مرحله استقرار از مهمترین مراحل در طی ریزازدیادی می باشددر طی این مرحله، ریزنمونه ها گندزدایی شده و در محیط کشت های استریل و در شرایطی عاری از بیماری زا، کشت می شوند. از اهداف اولیه مرحله استقرار تولید درصد بالایی از ریزنمونه­های عاری از آلودگی سطحی است. آلودگی­های درونی و ترشح ترکیبات فنلی از ریزنمونه ها،مرحله استقرار را مشکل­ساز می کند(استیکلن و اورابی،۲۰۰۵)^[۴۵].
۱-۳۳- ایجاد شاخساره و پرآوری و تکثیر انبوه از طریق واکشت­های متوالی
دومین مرحله از ریزازدیادی محسوب می شود که در آن ریزنمونه­ها تکثیر یافته و بر تعداد آنها افزوده می شود. بعد از عبور از مرحله استقرار، ریزنمونه ها باید به سمت شاخه زایی هدایت شوند، بنابراین با تغییرات هورمونی می توان به این امر نزدیک شد. همچنین محیط کشت می توان به همان صورت قبل باقی بماند یا اینکه تغییر کند که به نوع گیاه بستگی دارد ( سعادت و هنرتی ، ۲۰۰۲).
۱-۳۴- ریشه­زایی گیاهچه­های تولید شده
مرحله ریشه­زایی بستگی زیادی به مرحله پرآوری دارد زیرا نمونه ها بایستی از نظر طول شاخه ها، سطح برگ و توانایی لازم برای شروع یک زندگی اتوتروف مناسب باشند، چرا که شاخساره هایی که در این مرحله ریشه دار می شوند به محیط بیرون انتقال داده خواهند شد. این مرحله نیز با ترکیبات هورمونی متفاوتی همراه است و معمولاً از غلظت سیتوکنین ها کاسته می شود(پراکسی و همکاران، ۲۰۰۵)^[۴۶]. همچنین ریشه زایی در شرایط درون شیشه ای دارای چندین مزیت است: از جمله این که در مدت ریشه زایی کمتر در معرض بیماری ها و تنش­های محیطی قرار می گیرد و در نتیجه ریشه هایی استریل و گیاهان عاری از بیماری تولید می شود. از معایب این روش می توان از زیادتر بودن قیمت نهال ها برای تولید در سطح تجاری و محدود بودن رشد ریشه ها به فضای داخل شیشه نام برد. در رابطه با فاز ریشه­زایی، سعادت و هنری^[۴۷](۲۰۰۱) بالاترین درصد ریزشاخسارهای ریشه­دار شده را با IBA در مقایسه با NAA بدست آوردند. آنها همچنـین پیشنهاد کردند که القاء ریشه­زایی تحت شرایـط تاریکی(به مدت ۹ روز) در حضور اکسین صـورت بگیرد، این عمـل ریشـه­دار شدن ریز شاخـساره­ها را تا ۸۳% امکان­ پذیر مـی­ساخت. از طرف دیگر، سانچز-اولت^[۴۸] (۱۹۹۶) نشان داد که راندمان ریشه­زایی ۸۵ درصدی از القاء ریزشاخساره­ها در محیط کشت MS با عناصر اصلی رقیق شده تا ۲۵% در تاریکی مطلق حاصل می­ شود. زمان القاء به غلظت اکسین بکار رفته بستگی دارد. برای غلظت ۳ میلی گرم بر لیتر فاز القاء باید حداقل ۷ روز، در حالی که برای غلظت ۵ میلی گرم بر لیتر فاز القاء باید ۳ روز بطول بی انجامد. وحدتی و همکاران (۲۰۰۴) نشان دادند که اختلاف سرعت ریشه­زایی وابسته به نوع رقم استفاده شده است.
۱-۳۵- تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهان در شرایط درون‌ شیشه‌ای
با ظهور بیوتکنولوژی، شاخه جدیدی از تحقیقات در عرصه متابولیت‌های ثانویه گیاهی شکل گرفته است که به بیوتکنولوژی متابولیت‌های ثانویه معروف است. این شاخه بیوتکنولوژی به تولید درون شیشه‌ای متابولیت‌های ثانویه گیاهی و همچنین دست‌ورزی مسیرهای بیوسنتزی متابولیت‌های ثانویه برای تغییر الگوی تولید متابولیت در یک گیاه و یا تولید یک فرآورده ثانویه جدید در آن می‌پردازد. از اواخر دهه ۶۰ میلادی، فناوری کشت ‌بافت به عنوان ابزاری در جهت مطالعه و تولید متابولیت‌های ثانویه گیاهی معرفی شده است. برخی مزیت‎های تولید متابولیت‎های ثانویه از طریق کشت بافت شامل کنترل بهینه شرایط کشت، افزودن پیش­سازهای مورد نیاز برای افزایش بازده و تولید متابولیت‎های ثانویه خاص می‎باشد (راماچادرا و راویشانکر[۴۹]، ۲۰۰۲). در این رابطه از روش‌های زیر برای تولید متابولیت‌های ثانویه استفاده شده است:
۱-۳۶- روش کشت کالوس
تولید متابولیت‌های با ارزش اغلب به بافت‌های تمایزیافته نظیر کرک‌های غده‌ای و مجاری رزینی بستگی دارد. این قبیل ترکیبات را به طور معمول نمی‌توان در کشت‌های سوسپانسیون سلولی القاء کرد. استفاده از کشت‌های کالوس به جای سوسپانسیون سلولی درختان در برخی موارد منجر به تشکیل مجاری و غده‌هایی می‌شود که فرآورده‌هایی چون ترپن‌ها و روغن‌های فرار در آنها تولید می‌شود. البته این کشت‌های کالوس دارای پتانسیل قابل توجهی در راستای تولید متابولیت‌های ثانویه هستند (یومان[۵۰]، ۱۹۸۷).
۱-۳۷- روش کشت سوسپانسیون سلولی
استفاده از سیستم‌های کشت سلول گیاهی برای تولید متابولیت‌های ارزشمند، خصوصاً در صنعت مواد دارویی و غذایی (نیکل[۵۱]، ۱۹۹۰) ، عموماً یک فناوری مناسب محسوب شده و به سرعت در حال گسترش است (جدول ۱-۱). پیشرفت در زمینه کشت سلولی با استقرار موفق لاین‎های سلولی برخی از گیاهان دارویی که منتهی ‎به تولید درصد بالایی از ترکیبات ثانویه در شرایط کشت‎های سوسپانسیون سلولی می‌شوند، محقق می‌گردد، که این امر توسط برخی از محققان گزارش شده است (تریپادی[۵۲]، ۲۰۰۳).