Sesame oil (Sigma)
Entelan (Merck)
Xylene (Merck)
Peroxidase hydrogen (Merck)
Anti-Caspase 3 antibody (produced in rabbit, sigma)
Peroxidase conjugated goat anti rabbit IgG (sigma)
Triton x- 100 (Merck)
Paraformaldehyde (Merck)
Sodium dihydrogen phosphate (Merck)
Di- sodium hydrogen phosphate (Merck)
غذای مخصوص موش
گیمسا
3-2- وسایل و دستگاه ها
سمپلر 10-1 میکرولیتری
سمپلر100-10 میکرولیتری
سمپلر 1000-100 میکرولیتری
ترازو
قفس وظرف آبخوری موش
سرنگ انسولینی
جعبه open field
استوانه مخصوص آزمون شنا
دستگاه ماز بعلاوه مرتفع
دماسنج
هیتر
لام و لامل بلند
وسایل تشریح
ست پرفیوژن
3-3- روش انجام کار
موشهای صحرایی سفید آزمایشگاهی(Rat) از نژاد ویستار با وزن 180 تا 220 گرم از مؤسسه سرم سازی رازی تهیه شده و در اتاق حیوانات بخش زیستشناسی با دمای 2±22 درجه سانتیگراد و سیکل 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی نگهداری شدند. آب و غذا به میزان کافی در اختیار موشها قرار داشت. برای جفتگیری دو موش صحرائی ماده جوان با یک موش صحرائی نر در یک قفس قرار میگرفت. به منظور اطمینان از باردار بودن مادهها هر روز تست اسمیر از واژن موش گرفته میشد. جهت تست اسمیر از موش مادهای که برای جفتگیری در کنار موش نر قرار گرفته بود بوسیله قطره چکان نمونه واژینال تهیه و به لام حاوی یک قطره آب منتقل میشد. بعد از خشک شدن نمونه، برای فیکس شدن نمونه، روی آن الکل ریخته و صبر میکنیم تا خشک شود. و بعد روی نمونه گیمسا ریخته و ٢٠ دقیقه رنگ گیمسا را روی نمونه نگه میداریم تا کاملا رنگ بگیرد و بعد رنگ را شسته و نمونه را زیر میکروسکوپ مشاهده میکنیم. در صورت مشاهده اسپرم، حاملگی تأیید میشد. پس از بررسی میکروسکوپی و در صورت تشخیص حامله بودن، موش حامله از بقیه جدا شده و در قفس مجزا نگهداری
( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
میشد. این روز به عنوان روز صفر حاملگی در نظر گرفته میشد.
روز 15 بارداری، موشهای صحرایی ماده وزن شده و به صورت کاملاً تصادفی برای تیمار در یکی از گروه های مورد مطالعه انتخاب میشدند. موشهای صحرایی ماده حامله به سه گروه تقسیم شدند. مادران گروه کنترل در کل دوران حاملگی و شیردهی آب معمولی دریافت
میکردند. گروه شاهد از شروع روز پانزدهم حاملگی تا پایان روز هفت بعد از زایمان میزان 40 میلیگرم بر کیلوگرم ساخارین در روز به صورت محلول در آب معمولی دریافت میکردند. گروه آزمایش از روز پانزدهم حاملگی تا پایان روز هفت بعد از زایمان میزان 20 میلیگرم بر کیلوگرم در روز داروی اتوسوکسیماید به همراه 40 میلیگرم بر کیلوگرم ساخارین در روز را به صورت محلول با آب دریافت میکردند. از شروع روز پانزدهم مادران باردار گروه شاهد و آزمایش با احتیاط کامل به صورت یک روز در میان وزن میشدند. و میزان محلولی را که طی یک شبانه روز بایستی دریافت کنند تعیین کرده و در طی روز میزان محلول مصرفی به صورت متناوب به وسیله استوانه مدرج برحسب میلیلیتر سنجیده شده پس از دریافت میزان مناسب، در ادامه روز آب معمولی در اختیار مادران قرار میگرفت. تقریبا 21 روز بعد از شروع بارداری، موش صحرایی حامله زایمان می کند که روز اول زایمان را روز صفر تولد در نظرگرفته و فردای آن، به عنوان روز اول پس از تولد ثبت میشد. در روز اول پس از تولد در صورتی که تعداد نوزادان بیش از 8 سر بود تعداد 8 سر به صورت تصادفی انتخاب شده و بقیه پس از بیهوشی عمیق قربانی میشدند. مادر و نوزادها به طور یک روز درمیان وزن میشدند تا میزان محلول ساخارین و اتوسوکسیماید- ساخارین دریافتی تا روز 7 بعد از تولد مشخص شود.
در روز 9 پس از تولد از بین نوزادان هر مادر یک نر و یک ماده جهت پرفیوژن ترنسکاردیال و مطالعه مرگ نورونی آپاپتوتیک در هسته سجافی پشتی استفاد میشدند. نوزادان باقی مانده در روز 25 پس از تولد از مادر جدا میشدند و در روز 40 پس از تولد زادههای نر و ماده از هم تفکیک میشدند. از روز 60 بعد از تولد آزمون اضطراب در ماز بعلاوه مرتفع و شنای اجباری بر روی موشهای صحرایی انجام میشد.
شکل 3-1- تست اسمیر (اسپرمهای موش صحرایی)
3-4- آزمون حرکتی Open field
قبل از آزمون رفتاری، موشهای صحرایی وزن شدند و برای اطمینان از صحت فعالیت حرکتی موشهای صحرایی آزمون Open field انجام گرفت.
آزمون Open field یک آزمون حسی– حرکتی ساده[33] است که فعالیت پایه حیوانی[34] و تکامل آن در پاسخ به محیط جدید یا محیط اضطرابزا و درمان دارویی و ضایعه یا اصلاح ژنتیکی را مورد ارزیابی قرار میدهد (Denenberg, 1969).
جعبه Open field به شکل مکعبی با ابعاد40×40×40 است. کف آن با دو خط متقاطع به 4 قسمت برابر تقسیم شده است. تعداد دفعاتی که یک موش صحرایی در مدت 300 ثانیه از این خطوط عبور می کند به عنوان شاخصی از فعالیت حرکتی موش صحرایی در نظر گرفته می شود.
شکل 3-2- دستگاه تست فعالیت حرکتی
3-5- ماز بعلاوه مرتفع [35]
دستگاه ماز بعلاوه مرتفع دستگاهی است به شکل بعلاوه، با دو بازوی باز و دو بازوی بسته که در ارتفاع 70-40 سانتیمتری از سطح زمین قرار گرفته است. آزمون ماز بعلاوه یک آزمون نسبتاً جدید برای شناسایی سطح اضطراب و نیز تأثیر داروهای اضطرابزا و ضد اضطراب در موش صحرایی است. بطور طبیعی موش ها ورود کمتری به بازوهای باز، نسبت به بازوهای بسته دارند و در نتیجه به نسبت، زمان کوتاهی را در بازوهای باز میگذرانند. کاهش ماندن در بازوهای باز به نسبت ماندن در بازوهای بسته، بیشترین ارتباط را با رفتارهای اضطرابی و غلظتهای بالای کورتیکواسترون پلاسمای موش دارد (Hogg, 1996).
شکل 3-3- دستگاه ماز بعلاوه مرتفع
3-6- آزمون شنای اجباری[36]
این تست بر اساس فرار از محرک آزار دهنده پایهگذاری شده است و غالباً برای اندازه گیری اثر داروهای ضدافسردگی مورد استفاده قرار میگیرد. در این روش موش در یک استوانه شفاف پر شده از آب با درجه حرارت بین ℃30-24 قرار میگیرد، به صورتی که نمیتواند فرار کند. ارتفاع استوانه 30 سانتیمتر و قطر آن 20 سانتیمتر است. عمق آب باید به اندازهای باشد که حیوان نتواند کف استوانه را با پا یا دم خود لمس کند موش در ابتدا برای فرار از این وضعیت تلاش می کند، اما بعد از مدتی بیحرکت می شود. که این عدم تحرک به صورت شناور ماندن به حالت غیرفعال و یا فقط ایجاد حرکات لازم برای شناور ماندن مشخص می شود و شاخصی از میزان افسردگی است. رفتار موش در مدت زمان تلاش برای یافتن راهی برای خروج و نیز مدت زمان عدم تحرک ثبت و محاسبه می شود. این تست در دو جلسه انجام میشد، به صورتی که در روز اول موش به مدت 15 دقیقه درون استوانه قرار میگرفت و رفتار موش در 5 دقیقه اول ثبت میشد. 15 دقیقه بعد از اتمام جلسه اول به موش داروی فلوکستین با غلظت mg/kg10 به صورت داخل صفاقی تزریق میشد. به همین ترتیب، موش 20 و 23 ساعت بعد از آغاز جلسه اول این غلظت از فلوکستین را دریافت میکرد. جلسه دوم آزمون شنای اجباری به مدت 5 دقیقه انجام و ثبت میگردید. نتایج حاصل از این آزمایش به این صورت تفسیر می شود که زیاد بودن مدت زمان عدم تحرک، یک رفتار مرتبط با روحیه منفی و نوعی ناامیدی (افسردگی) در موش است.
شکل 3-4- آزمون شنای اجباری
3-7- آماده سازی محلولهای پرفیوژن
برای تهیه بافر فسفات 2/0 مولار، 56/1 گرم فسفات سدیم مونوبازیک و 07/7 گرم از فسفات سدیم دی بازیک را در 200 میلیلیتر آب مقطر حل میکنیم، سپس حجم محلول را به 250 میلیلیتر میرسانیم.
برای تهیه پارافرمالدئید 8%، 12 گرم پارافرمالدئید به 150 میلیلیتر آب مقطر اضافه کرده و ضمن مخلوط کردن تا دمای 67 درجه سانتیگراد حرارت میدهیم. سپس به آهستگی یک قطره محلول سود 1 نرمال اضافه میکنیم تا محلول بیرنگ شود. سپس محلول را از کاغذ صافی عبور داده و پس از سرد شدن در ظرف در بسته و در یخچال نگهداری میکنیم. به منظور آماده سازی پارافرمالدئید 4% در بافر فسفات 1/0 مولار، حجمهای مساوی از بافر فسفات 2/0 مولار و پارافرمالدئید 8% را به هم میافزائیم.
