هرکدوم از مخلوطها واسه ۶۰ دقیقه در ۷۰ درجه سانتی‌گراد موندن تا عکس العمل داده و بعد اونا رو در دمای اتاق خنک کردن و با۵۰ میکرولیتر HCl 3/0 مولار خنثی کردن.
محلول حاصل رو با کلروفرم (۱ میلی‌لیتر) استخراج کردن و روند شستشو رو ۳ بار تکرار کردن.
بعد لایه آبی رو با فیلتر غشایی ۴۵/۰ میکرومتر فیلتر کردن (۴۴).
در مقاله” ژانگ” در سال ۲۰۰۹ جدا‌سازی منوساکاریدهای حاصل از هیدرولیز فوکویدان با PMP این‌اینجور توضیح داده شده:
اونا ۱۰۰ میکرولیتر محلول متانولی PMP (5/0 میلی‌مول) و ۱۰۰ میکرولیتر محلول آبی سود(۳/۰ میلی‌مول) رو به ۱۰۰ میکرولیتر محلول منوساکارید منبع یا محلول فوکویدان زنده شده اضافه کردن. مخلوط در دمای ^oc ۷۰ واسه نیم ساعت گرمخانه‌گذاری شد. بعد اونو در دمای ۸ درجه سانتی‌گراد خنک کرده و با ۱۰۰ میکرولیتر محلول اسید‌کلرید‌ریک (۳/۰ میلی‌مول) خنثی کردن. بعد ۱ میلی لیتر کلروفرم اضافه کردن و مخلوط تکون داده شد و در ۵۰۰۰ دور در‌ دقیقه واسه ۱۰ دقیقه در ۶-۸ درجه سانتی‌گراد، سانتریفوژ شد. لایه کلروفرم دور انداخته شد و لایه آبی رو ۲ دوباره با کلروفرم استخراج کردن. لایه آبی پایانی رو بطور مستقیم به HPLC تزریق کردن (۶۶).
در سال ۲۰۰۷ در صورتجلسه کمیته علمی مصرف کنندگان غذا درباره فنیل متیل پیرازولون مطالبی چاپ کردن. در این صورت جلسه PMP به عنوان پودری با رنگ بژ با وزن مولکولی ۲/۱۷۴ که در نور ماورای بنفش بیشترین حد طول موج اون ۹/۲۴۴ نانومتره اومده و در مصارف کروماتوگرافی مایع باید خلوص بالای ۵/۹۹ رو داشته باشه. هم اینکه اونا تحقیقات انجام شده از اثر دوزها و زمان_­ های مصرف جور واجور PMP رو بر ارگانای جور واجور بدن رو با آزمونای بیولوژیکی جور واجور بررسی کردن و یافته ها رو در این صورتجلسه گزارش کردن (۲۶).
“۲۷” محتوای منوساکاریدها رو در هیدرولیزهای یه جور ماست و آب‌پرتقال با جدا‌سازی منوساکاریدها به کمک ρ- آمینو بنزوئیک ‌اسید ‌اتیل ‌استر بررسی کردن. اونا جداسازی منوساکاریدهای جدا شده با ρ- آمینو بنزوئیک ‌اسید ‌اتیل‌ استر(ABEE) رو با HPLC که دارای ستون میکرو‌پک با فاز ثابت آلتیما C بود انجام دادن. غلظت منوساکاریدها براساس مساحت پیک /ارتفاع تکرارها اندازه‌گیری شد. جدا‌سازی ABEE فروکتوز و جستجوی اون قبل از این بطور موفقیت‌آمیزی انجام نشده بود.
در این تحقیق اونا ۲ پیک واسه ABEE -فروکتوز ، تو یه نسبت ثابت گرفتن.
واسه اثبات اعتبار روش، غلظت گلوکز، گالاکتوز و فروکتوز با دو روش جدا‌سازی ABEE و کروماتوگرافی با آشکارساز ماورای بنفش (UVD) در مقایسه با کروماتوگرافی آشکارساز ضریب شکست و بدون جدا‌سازی رو مقایسه کردن.
غلظت‌های بدست‌اومده منوساکاریدها در دو روش کروماتوگرافی به هم نزدیک بود و دامنه خطای بدست اومده قابل قبول بود (۲۸).
اونا جدا سازی رو به روش زیر انجام دادن:
بخشی از نمونه ۱۰۰ میلی‌لیتری هیدرولیز شده یا یه نمونه استاندارد رو با Lµ ۸۰ اسید استیک، Lµ ۸۰ NaBH₃CN 4/1 مولار و Lµ۴۰۰ ρ- آمینو بنزوئیک ‌اسید اتیل ‌استر(ABEE) مخلوط و در ۸۰ درجه سانتی‌گراد به مدت نیم ساعت گرم کردن بعد در دمای اتاق خنک کردن (۲۸).
هم اینکه اومده کربوهیدراتها معمولا نور ماورای بنفش رو جذب نمی‌کنن. بنا‌براین رو‌ه ‌حل اضافه کردن یه ماده رنگساز به مولکول کربوهیدرات بیشتر در روش جذب UV در طول موج انتخابیه (۲۸).

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

روش‌های جدا‌سازی آنالیزهای کروماتوگرافی رو قادر می‌سازه که روشی با حساسیت بسیار بالا و در دامنه غلظتی بسیار پایین رو بدست بیارن (۲۸).
در مقالات گروه بزرگی از معرفای جدا‌ساز واسه منوساکاریدها گزارش شده. مثل ۳-‌متیل ۱-فنیل۲-پیرازین، ۸-آمینوپیرن۱،۳،۶-تری‌سولفونات، بنزآمیدین، FMOC-هیدرازین، فنیل‌ایزوسیانات، ۲-آمینوبنزوئیک‌ اسید، ρ- آمینو بنزوئیک‌اسید ‌اتیل‌استر، آمینوپیرازین. در میان اونا تا حالا جدا‌سازی فروکتوز با ρ- آمینو بنزوئیک اسید‌اتیل‌استر گزارش نشده‌است (۲۸).
در سال ۲۰۱۱” استپان و استاچر” روی بهینه‌سازی اندازه‌گیری منوساکاریدها با به کار گیری اسید آنترانیلیک و ۱-فنیل-۳-متیل-۵-پیرازولون واسه آنالیزهای گاستروپود (حلزونها) تحقیق کردن. اونا روش‌هایی رو واسه اسید آنترانیلیک (AA) و ۱-فنیل-۳-متیل-۵-پیرازولون (PMP) بهتر کردن و جداسازی منوساکاریدهای مشخص با HPLC انجام شد. ۲۶ منوساکارید رو با این روش بررسی کردن. محدوده جستجو واسه مشتقات AA، fmol 65 بود و کمیت‌های بدست اومده تا nmol200 تحت شرایط آزمون قابل‌اعتماد بودن. اونا به این نتیجه رسیدن که مشتقات PMP محدوده جستجوی بالاتری رو نشون می‌دهد اما با امکان کیفی‌سازی تعداد بیشتری نمونه (۵۸).
“گومیز و همکاران “منوساکاریدهای آب سیب رو به روش زیر جدا‌سازی کردن:
روش بکار‌رفته واسه جدا‌سازی آلدوز‌ها و اسیدهای ‌اورونیک در انتهای زنده کننده اونا با ABEE طبق روشWang انجام شد.
تو یه محلول نمونه شامل µmol 100 قند در ۵ میلی‌لیتر آب، ۴۰۰ میکرولیتر NaBH₃CN 4/1 مولار در آب ‌مقطر،۴۰۰ میکرو‌لیتر اسید ‌استیک گلسیال و ۲ میلی‌لیتر ABEE 6/0 مولار در متانول اضافه کردن. مخلوط در ۸۰ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۰ دقیقه گرما دید. پس از خنک‌سازی در دمای محیط، به اون ۲ میلی‌لیتر آب مقطر اضافه کردن. فاز آبی رو با ۴ میلی‌لیتر کلروفرم استخراج کردن تا ABEE اضافی حذف شه و لایه آبی نمونه رو با روش HPLC بررسی کردن (۳۵).
روش هیدرولیز کربوهیدرات جلبک به وسیله وان‌ویچن و لارنس در سال ۲۰۱۳ اصلاح شده. واسه هیدرولیز از اسید سولفوریک ۷۲% استفاده کردن و یه ساعت محلول صمغ و اسید در دمای ۳۰ درجه‌ سانتی‌گراد و یه ساعت در دمای ۱۲۱درجه‌سانتی‌گراد اتوکلاو و ۱۵ دقیقه در اتوکلاو درباز و هم یه ساعت در دمای اتاق نگهداری شد تا به دمای محیط برسه و واسه اسپکتروفتومتری آماده شه (۶۰).
واسه تنظیم pH درآنالیز با HPLC از کربنات‌ کلسیم استفاده کرده‌ان.
۲-۶ اندازه‌گیری منوساکاریدها:
در ۲۰۱۳ سوزانه گوئیج در آخر نامه خود که روشای بررسی کمی قندهاه شکلای جور واجور روشای بررسی قندها رو به روش میکرو توضیح داده. شکلای جور واجور روشای کروماتوگرافی مایع، کروماتوگرافی رد و بدل کردن یون، گاز کروماتوگرافی و الکتروفورز مویین به همراه شکلای جور واجور ستونا و آشکارسازهای استفاده شده در تحقیقات جور واجور توضیح داده شده. در کروماتوگرافی مایع آشکارسازهای ^[۱۹]ELSD، ^[۲۰]RI، UV^[21]، MS^[22]، فلورسانس، ^[۲۳]CAD استفاده شدن هم اینکه در کروماتوگرافی رد و بدل کردن یون آشکارسازهای PAD^[24] و HPAEC^[25] با آشکارساز جرمی(MS) استفاده شدن (۳۴).
در سال ۲۰۰۵ در هندوستان “هیوک و همکارانش” از راه HPLC واسه اندازه‌گیری سوربیتول خون افراد دیابتی استفاده کردن و بنزوله‌کردن جهت جدا‌سازی در پیش‌ستون انجام شد و ستون C-18 و آشکارساز UV واسه بررسی استفاده شد. حساسیت روش واسه اندازه‌گیری سوربیتول، ۵ نانوگرم بر میلی‌لیتر بود. از این روش مقادیر گلوکز، زایلیتول، فروکتوز، میواینوزیتول، گالاکتوز، گالاکتیتول و سوربیتول اندازه‌گیری شدن ( ۳۶).
“سیلوا و همکاران” در سال ۲۰۱۳ اندازه‌گیری آلدوزها و داکسی‌آلدوز‌ها و اسیدهای ‌اورونیک رو در عصاره غنی پکتین با روشRP-HPLC-FLD بعد از جدا سازی با ρ-AMBA انجام دادن.
یه روش فاز برعکس کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا با آشکارساز فلورومتریک واسه جستجوی همزمان نوعای جورواجور قندهای خنثی مثل هگزوزها (گالاکتوز، گلوکز، مانوز)، پنتوز‌ها (آرابینوز، زایلوز)، داکسی–هگزوز‌ها (فوکوز، رامنوز) و قندهای‌اسیدی (گالاکتورونیک اسید و گلوکورونیک اسید) پیشنهاد شد.
جداسازی با یه ستون C18 پک شده با ترکیب انتهای آبدوست، به دنبال یه ستون جدا سازی شده با ρ-آمینوبنزوئیک اسید انجام شد.
جستجوی فلورومتریک جدا شده‌ها وابستگی قوی با pH فاز متحرک داشت و بازیابی قندها بین ۷±۷۷ و ۳±۱۰۳% بود.
واسه قضاوت بهتر روش، قندهای خنثی عصاره پرتقال غنی از پکتین با روش GC-FID با جدا‌سازی با استات ‌آلدیتول، بررسی شد. آزمون آماری Tجفتی، نشون داد که فرقی بین دو روش وجود نداره (۴۳).
هم اینکه “۳۲اندازه‌گیری منوساکاریدها، دی‌ساکاریدها‌ و الیگوساکاریدها در نمونه‌های مشابه گیاهی با روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا رو انجام دادن.
یکی از روشای بسیار مهم کیفی و کمی آنالیزی منو و الیگوساکاریدها با روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا در پیوند با ستون آمینوفازیه که با اندازه ذرات ۵ تا ۱۰ میکرومتر به وسیله شرکتهای واترز، واتمن، مرک و بقیه ساخته شده. در همه این موارد یه سیلیکاژل که با روش شیمیایی اصلاح شده پیوند شده و به عنوان جاذب گروه آمینوپروپیل استفاده شده و استونیتریل آبی (ACN) به عنوان حلال بکار می‌رود.
نسبت بین آب و استونیتریل آبی در فاز متحرک وابسته به طبیعت ترکیبات مورد تحقیقه و محتوای فروکتوز، گلوکز، ساکارز، ملی‌بیوز و بعضی مالتودکسترین‌ها در هیدرولیزهای نشاسته اندازه‌گیری شدن.
این آزمون نشون داد که فاز متحرک شامل ۷۵% استونیتریل آبی، واسه جداسازی الیگوساکاریدها بسیار مناسبه؛ درحالیکه سیستم با محتوای استونیتریل بالاتر باید واسه کروماتوگرافی منوساکاریدها استفاده شه.
درطول کروماتوگرافی با ۷۵% استونیتریل آبی، فروکتوز و گلوکز در زمان جلوگیری‌شون بر هم منطبق می شن اما میشه با ۹۰% استونیتریل آبی اونا رو از هم جدا کرد. در این تحقیق آشکارساز مورد استفاده آشکارساز ضریب شکست بوده(۳۳).
“لو و همکاران” در سال ۲۰۰۹ روی جداسازی و بهینه سازی اجزای منوساکارید پلی ساکاریدهای چای از ژینوستما پنتافیلوم با روش HPLC و آشکارساز UV کار کردن.
در این تحقیق، اونا یه روش فاز برعکس کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا رو واسه اندازه‌گیری همزمان آلدوزها و اسیدهای اورونیک توضیح داده‌ ان.
جداسازی رو روی ستون RP-C18 (250mm×۴٫۶ mm iD,5 µm,، ونسیل آمریکا) و با‌ به کار گیری پیش ستون انجام دادن. جدا‌سازی با ۱-فنیل۳-متیل۵پیرازولون(PMP) و آشکارساز UV درطول ‌موج nm.250 انجام شد.
اونا ۱۰ جدا PMP از مانوز، ریبوز، رامنوز، گلوکورونیک اسید، گالاکتورونیک ‌اسید، گلوکز، گالاکتوز، آرابینوز و فوکوز درزمان ۴۰ دقیقه از خط پایه جدا کردن.
هم اینکه این روش در بررسی کمی اجزای منوساکاریدها در پلی‌ساکاریدهای محلول در آب استخراج شده از چای “ژینوستما پنتافیلوم ماکینو” انجام داد و یافته ها نشون داد که پلی‌ساکارید چای یه جور هتروپلی‌ساکاریده که دارای مانوز، ریبوز، رامنوز، گلوکورونیک‌اسید، گالاکتورونیک‌اسید، گلوکز، زایلوز، گالاکتوز و آرابینوز در مقادیر ۳/۱۶، ۳/۱۰، ۱/۴۷، ۶/۵، ۰/۲۴، ۴/۱۲۸، ۰/۲۵، ۴/۱۰۱ و ۱/۷۱ میکروموله.
بازیابی مقادیر منوساکاریدها در پلی‌ساکارید چای در دامنه ۱۰۸ – ۶/۹۴% و درجه RSD اون کمتر از ۹/۴% بود.
اونا به این نتیجه رسیدن که روش HPLC پیشنهادی واسه آنالیزهای پلی‌ساکارید چای ژینوستما پنتافیلوم دقیق و تکرار‌پذیره.
PMP با کربوهیدراتهای احیا‌کننده تحت شرایط ملایم عکس العمل می‌دهد و نیاز به کاتالیست اسیدی نداره و باعث ایزومریزاسیون و دسیلاسیون نمی‌شه (۴۳).
هم اینکه اونا آنالیزهای منوساکاریدهای جدا شده با PMP رو روی دستگاه HPLC شیمادزو (Shimadzu LC-2010A ) مجهز به یه پمپ گرادیانی ، یه آشکارسازUV-Vis(190- 700 نانومتر)، و یه نمونه‌گیر^[۲۶] خودکار (۱۰۰- ۱/۰ میکرولیتر) و ستون با امکانات تنظیم دما (۲۷۳-۳۳۳ کلوین) انجام شد.
ستون آنالیتیک مورد استفاده یه ستون RP-C18 (6/4 میلی‌مترI.D. ×۲۵۰ میلی‌متر .۵ میکرومتر.Venusil.USA).
طول موج آشکارساز UV 250 نانومتر بود. شستشو و جداسازی در فلوی ۰/۱ میلی‌لیتر در دقیقه در ۳۵ درجه سانتی‌گراد انجام شد.
فاز متحرک A رو استونیتریل و فاز متحرک B رو بافر ۰۴۵/۰% KH₂PO₄- 05/0% تری‌اتیل‌آمین(pH:7) در نظر گرفتن. با به کار گیری یه گرادیان شستشوی ۹۰-۸۹-۸۶% فاز B، با کم شدن خطی در زمانای ۰-۱۵-۴۰ دقیقه بررسی انجام شد. حجم تزریق نمونه ۲۰ میکرولیتر بود (۴۴).
“ژانگ” در سال ۲۰۰۹ روی بررسی منوساکاریدهای فوکویدان با پیش‌ستون جدا‌سازی HPLC تحقیق کرده ‌است. اون توضیح می‌دهد که یه روش HPLC رو واسه بررسی ترکیب منوساکاریدی فوکویدان پیشرفت داده‌ان. فوکویدان با ۲ مول ‌بر ‌لیتر تری‌ فلوئورو استیک ‌اسید به منوساکاریدها هیدرولیز شد. ریبوز به عنوان استاندارد داخلی استفاده شد. جدا‌سازی منوساکاریدها با PMP انجام شد و با آشکارساز ماورای بنفش در ۲۴۵ نانومتر جستجو شد. در دامنه غلظت ۲- ۱/۰ میلی‌مول بر‌لیتر، مساحت پیک هر منوساکارید رفتار خطی خوبی با غلظت نشون می‌دهد (r²›۹۹۸/۰). متوسط مقادیر بازیابی مانوز، رامنوز، گلوکورونیک‌اسید، گلوکز، گالاکتوز، زایلوز و فوکوز عبارتند از: ۲/۸۶%، ۱/۹۵%، ۵/۶۲%، ۰/۱۰۲%، ۹۴%، ۶/۶۶% و ۱/۱۰۵%.
این روش دقیقه و دارای تکرارپذیری مناسبیه و می‌تونه واسه اندازه‌گیری محتوای منوساکارید فوکویدان بکار رود.
هم اینکه شرایط کروماتوگرافی به توضیح زیر بود:
ستون : (YMC-Pack ODS – AQ(250×۴٫۶mm×۵ µm
در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد
حلال A: 4/0% تری‌اتیل‌آمین در ۲۰ نانومول محلول بافر ‌آمونیوم ‌استات (۳/۶:pH) با اسید‌استیک- استونیتریل(۹:۱)
حلال B: 4/0% تری‌اتیل‌آمین در ۲۰ نانومول محلول بافر ‌آمونیوم ‌استات (۳/۶:pH) با اسید‌استیک- استونیتریل (۴:۶)